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有读书笔记Quantitative proteomic analysis of purified yeast kinetochores identifies a PP1 regulatory subunit

热2 阿平 添加于 2009-12-4 07:45 | 3682 次阅读 | 2 个评论

  •  作 者

    Akiyoshi B, Nelson CR, Ranish JA, Biggins S

  •  摘 要

    The kinetochore is a macromolecular complex that controls chromosome segregation and cell cycle progression. When sister kinetochores make bioriented attachments to microtubules from opposite poles, the spindle checkpoint is silenced. Biorientation and the spindle checkpoint are regulated by a balance between the Ipl1/Aurora B protein kinase and the opposing activity of protein phosphatase I (PP1). However, little is known about the regulation of PP1 localization and activity at the kinetochore. Here, we developed a method to purify centromere-bound kinetochores and used quantitative proteomics to identify the Fin1 protein as a PP1 regulatory subunit. The Fin1/PP1 complex is regulated by phosphorylation and 14-3-3 protein binding. When Fin1 is mislocalized, bipolar spindles fail to assemble but the spindle checkpoint is inappropriately silenced due to PP1 activity. These data suggest that Fin1 is a PP1 regulatory subunit whose spatial and temporal activity must be precisely controlled to ensure genomic stability.

  •  详细资料

    • 文献种类:期刊
    • 期刊名称: Genes & Development
    • 期刊缩写: Genes Dev
    • 期卷页: 2009年
    • 地址: Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington 98109, USA
    • ISBN: 1549-5477
    • 备注:PMID:19948764

  •  所属群组

    分享细胞周期  

  •  标 签

    PP1  有丝分裂 

  • 相关链接 DOI URL 

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    此文与我所研究的内容很可能相关，在faculty of 1000上为推荐阅读级别为 must read

    这篇文章最重要的贡献是在取得kinetochore complex的方法学上取得了重要的进展，他们采用LacO-LacI minichromosome的方法取得更加纯的并且完整的kinotochore complex，虽然我对minichromosome和一般chromosome的相似程度还有疑问。但是从其质谱得到的数据来看，大部分已经被鉴定的knetochore蛋白还是在其中的。

     

    另外一个做kinetochore complex需要特别注意的是使用裂解液的盐浓度，300mM KCL会破坏kinetochore结构，而150mM KCL（细胞內液生理浓度）则不会破坏这个复合物。再提一个小小的知识点，细胞內液的钾离子浓度是150mM，而细胞外液的钾浓度不到胞内1/30，细胞外液的钠浓度是150mM，而细胞內液的钠浓度则低到胞外1/20，所以我们在做一些 in vitro实验的时候，往往采用150mM KCL或150mM NaCL作为生理盐浓度，当然个人会去选择150mM KCL，因为那个更加生理。

    最近也研究了不少提取chromatin-associated protein的方法，但是也遇到不少问题，不是蛋白质提取量不够就是复合物已经被破坏，再则是酶活性已经改变。最近似乎有点头绪，但是还没有完全做出来。有兴趣的同行可以和我讨论一下。

     

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