GFP在转基因动物研究中的应用

Dr.LinZhen

目前，小鼠已成为哺乳动物遗传研究中首选的模式生物。经过过去几十年的努力，培育基因打靶和转基因小鼠已经变成很平常的工作，以目前的技术可以获得在核酸水平上的突变品系。现在，诸如此种基因组修饰变得越来越精细，而在基因水平上标记不同的细胞群已成为非常普遍的研究。
虽然Lac Z，即细菌β-半乳糖苷酶基因仍在许多小鼠研究中作为筛选标记，但GFP在小鼠中的应用更具吸引力。由于GFP自身的特点，它能够在体内或体外进行实时监测。GFP还有另一个优势，能采用流式细胞仪、共聚焦显微镜及荧光计等技术进行定量检测。目前，人们已经改进了野生型GFP基因，从中获得的几种变体在热稳定性和荧光强度等方面都有所增强。增强型GFP（EGFP）就是其中之一。现在，它已普遍应用于转基因或基因打靶小鼠。更为重要的是，人们现在已经开发出多种GFP光谱变体，其中两种全新颜色的变体——增强型黄色荧光蛋白（EYFP）和增强型蓝绿色荧光蛋白（enhanced cyan fluorescent protein, ECFP）已应用于小鼠研究中。
由于ECFP和EYFP的谱线轮廓截然不同且没有重叠，所以这两种荧光蛋白可同时用作报告基因并共同显色，这对体内双标记或荧光能量转移分析等研究是非常理想的。GFP及其颜色变体作为报告蛋白的应用为科学研究提供了一个空前的高精度检测方法，代表着小鼠基因组改造技术的未来发展方向，并开启了在同一个动物体内应用组合无创性报告基因的广阔前景。
本章节主要综述彩色小鼠的生产，即以GFP为基础的报告基因在小鼠基因打靶和转基因方面的应用及进展。另外，我国科学家于2007年通过体细胞核移植，成功获得了绿色荧光蛋白转基因猪，也值得关注。
2.1 基因打靶和胚胎干细胞（ES）技术
基因打靶和胚胎干细胞技术的出现为小鼠基因组操作引进了新的方法。胚胎干细胞是来源于后胚泡期胚胎的多能干细胞系，经体外繁殖和处理后可再导入胚胎。自人们从胚胎干细胞克隆出小鼠生殖细胞，并证明将亲本的基因组传递给后代后，胚胎干细胞就成为常用的工具。现在，只要在体外进行基因打靶和转基因操作，就可通过生殖细胞将亲本的基因组传递给后代。
在胚胎干细胞中可进行两种基因组改造：定向改造和非定向改造。定向改造就是预先确定并精确设计所要做的改变，基因打靶就是定向改造。非定向改造是随机的，包括转基因和突变。研究中，这两种方式可混合使用以达到不同的目的。
同源重组和点特异重组可对基因组进行任何想要的改变。可通过多种方式进行随机突变，利用外源基因陷阱载体可在基因组中随机定位，从而“劫持”基因表达并破坏基因功能。胚胎干细胞的另一种应用是转基因，它与经典的原核注射类似。在体外，将载体自身的驱动目的基因（通常为报告基因）的启动子整合入基因组，然后导入体内。因此，任何改造都能够导入胚胎干细胞，随后通过生殖细胞传递给后代，这样就可以建立小鼠突变品系或嵌合体，从而进行原位研究了。由于转基因细胞系能在体外增殖，所以与DNA注射相比，用ES细胞制备转基因动物的优势在于，可在动物模型体外使用试剂进行研究。
2.1.1 报告系统
一直以来，追踪研究发育及疾病过程中细胞的命运、迁移和增殖等的变化都是一种挑战。研究人员会使用不同的标签基因来追踪不同成分，尤其在基因突变（敲除）动物中得到广泛的应用。LacZ是常用的嵌合体突变标签，而另一个报告基因则是人胎盘碱性磷酸酶（hPLAP）。但是，它们都需要通过样本固定过程和经酶显色反应。而荧光蛋白（fluorescent protein, FP）报告基因则比酶类报告基因有优势，它们可定量、无需实验样品处理并且是无创的。多年来，多种外源荧光染料，如DiI或DiO的应用已经证明它们在荧光标记中的作用。但是，由于它们不是基因水平上的标记，观察的窗口期很短，而且不能向下遗传，所以无法应用于基因打靶和转基因动物。
1992年，人们首次克隆出GFP，并随后在线虫中表达GFP并检测到荧光，从而确立了新型GFP基因报告系统。
2.1.2 GFP——一个出众的荧光蛋白报告分子
在生物发光水母Aequorea victoria体内，当能量从钙激活的发光蛋白转移至GFP时就会发光。GFP可在不同的系统中表达，当受到适当波长的光（主峰在400nm附近，次峰在470nm附近）激发后，GFP就会发出绿色荧光并在505nm附近达到高峰。研究人员已经证实这种发光蛋白被激发后发出荧光是种属非依赖性的。
GFP发色团包括一个环形三肽Ser65-Tyr66-Gly67，并且只有在完整的GFP蛋白中才能发出荧光。GFP有单体和二聚体两种形式，二者的比例取决于蛋白浓度及周围环境。由于在多种系统中能监测到GFP活性，一般认为其发出荧光的过程是自身催化的或仅需要广泛存在的细胞因子。
GFP可以作为报告基因，且标记过程是无创的，这一特点吸引着人们的注意力。因此，GFP不仅可以作为基因表达的标签或经改构后的融合蛋白用于亚细胞定位，而且可在体外或原位实时监测。另外，GFP分子很小，仅为27KD，它主要以单体形式发挥功能；而lacZ就大得多，达135KD，并且以四聚体形式发挥功能。因此，GFP作为报告基因从本质上更适合用作融合蛋白。
2.1.3 GFP变体——热稳定荧光蛋白谱
野生型GFP（wild type GFP, wtGFP）从一开始就引起了人们极大的兴趣，而且被用作新型的简单报告基因及体内标记。wtGFP在线虫中表达成功，促进了它在转基因动物和植物，包括果蝇（Drosophila）、斑马鱼（Danio rerio）和粘液菌（Dictyostelium）等中的应用。虽然在多种生物中获得成功，但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。例如，在植物拟南芥中表达的wtGFP被截短，因为在其编码序列中有一个隐蔽型的内含子，造成mRNA加工异常。另外，研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP。起初，wtGFP在小鼠中的应用未能获得与在线虫中相同的应用效果，其主要原因是wtGFP在37℃的热稳定性差。这些都阻碍了它在小鼠基因打靶和转基因中的应用。
这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。现在，人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白，它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变，热稳定性和荧光强度得到了提高，GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。
现在，应用最为广泛的是红移变体增强型GFP（EGFP）。诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动，大约为490nm，这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜的常用波长。EGFP有两个氨基酸突变（表3），当被蓝光激发时，它发出的荧光要比wtGFP亮30-40倍。wtGFP和包括EGFP在内的多数变体半衰期长，所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。
为克服这一问题，人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）。原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）基因的C-末端。ODC含有一个PEST序列，这个序列可促进该蛋白在细胞内的降解。虽然，目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用，但这些变体有利于实时追踪基因表达动力学的研究。另一种红移变体是增强型黄色荧光蛋白（EYFP），该变体有四个氨基酸突变（表3）。在527nm时，EYFP的发射光从绿色变为黄绿色（图11）。EYFP荧光的亮度水平与EGFP相当。
在光谱的另一端是蓝色/蓝绿色变体，包括增强型蓝色荧光蛋白（EBFP）变体。它有四个氨基酸突变，激发波长和发射波长分别为380nm和440nm。由于这些突变改进了蛋白折叠和发色团形成的效率，所以也增强了所发出荧光的亮度（与蓝色变体相比）和蛋白溶解性。但唯一的不足之处，就是EBFP产生的荧光信号大致与wtGFP相当。
增强型蓝绿色荧光蛋白（ECFP）是发出蓝色/蓝绿色荧光的另一种变体，产生的荧光信号要比wtGFP强。ECFP有六个氨基酸突变（表3），发射光谱从绿色迁移到蓝绿色，最大激发波长在433nm（主峰）和453nm（次峰），最大发射在475nm，于510nm处有一肩峰（图11）。ECFP另一特点是比其它蓝色/蓝绿色变体光漂白效应弱，而且比EBFP的亮度强。
值得一提的是，wtGFP的主要绿色荧光变体，如EGFP等已经在ES细胞、基因打靶和转基因小鼠研究中得到充分应用。

2.1.4 GFP为基础的报告系统在基因打靶和转基因中的应用

1995年，Ikawa第一次将以GFP为基础的荧光蛋白报告系统应用于小鼠。他们的研究表明，在胚胎着床前，利用GFP快速无创地筛选转基因胚胎是切实可行的。荧光报告系统的另一个优点是，所获得的转基因的类型（纯合子、半合子）可能与荧光强度有关。

许多实验室应用ES细胞作为转基因工具来检验wtGFP变体。如图12所示，表达荧光蛋白的转基因ES细胞可以生成嵌合体胚胎，该嵌合体胚胎，在导入假孕雌鼠前的桑葚期就能被鉴定。目前，人们已经建立了一些转基因小鼠品系，这些品系有些是通过经典注射技术获得，有些则通过ES细胞转基因技术获得。它们从八细胞桑葚期到成年鼠都能发出荧光。如图13所示，这些荧光蛋白在小鼠的各个发育时期和成年期都能作为标记应用。

2.1.5 表达荧光蛋白小鼠的新应用——荧光激活细胞分选（FACS）

GFP作为报告系统在基因打靶和转基因小鼠中的应用，引发了一些新的很有应用前景的方法的建立和应用。从复杂的组织中获得感兴趣的细胞类型对现代生物学的许多领域都是有益的。

以前，多数分选特殊细胞类型的策略，都是采用荧光标记的抗体来标记细胞或者用染料来标记。GFP为基础的报告系统的出现解决了这一问题，它很容易就能分离得到表达报告基因的细胞。用适当的倒置荧光光学设备，就能观察到表达荧光蛋白的活细胞在整个胚胎或成体中的分布情况。用酶将成体动物组织或整个胚胎的不同细胞层分离，然后进一步制成单细胞悬液，就可以直接用流式细胞仪进行检测，并能分选得到标记有荧光蛋白的目的细胞。图14是该技术平台基本原理的说明。图中的例子是转基因胚胎的心脏细胞亚群表达荧光蛋白。取出心脏，捣碎后被流式分选成两群细胞：FP+和FP-。这一方法适用于所有的组织和器官。

已经有多个研究证实了这一方法的可行性。这些研究都表明，能够从表达EGFP的转基因小鼠中分离获得FP+细胞。目前，研究人员已经成功地从转基因胚胎中分离得到纯的原生殖细胞、神经管细胞及心脏细胞等。另外，他们还从Col2-EGFP转基因小鼠的肋骨细胞悬液中分选到软骨细胞，从而证明荧光亮度（强度）与原骨胶原II的生物合成是相关的。另一个研究则从成年小鼠皮肤中分离得到了毛乳头细胞。纯的FP+毛乳头细胞亚群在皮肤重建试验中非常有用，可用来研究毛发毛囊诱导和维持所需要的信号通路。

原则上讲，这种方法可用来回收任何有荧光标记的细胞，包括转基因动物、带有条件激活FP报告基因的动物、FP+ES细胞在桑葚胚或注射胚泡产生的嵌合体、将FP+胚胎滋养层干细胞注射到胚泡生成的特殊嵌合体、基因敲除的FP+ES细胞纯合子四倍体胚胎，甚至被含有FP报告基因的病毒感染的动物等。这种从复杂生物结构的多种细胞中分离单个细胞的方法，可用来建立细胞系，可以定义蛋白表达的空间区域，还能更容易地研究相关细胞在野生型与突变动物中的不同功能。

2.1.6 表达多种荧光蛋白的小鼠的新应用——应用多种无创的报告基因的可行性

虽然，目前大多数基因打靶或转基因研究中多以EGFP变体荧光蛋白作为报告基因，但并非仅有这种变体能在小鼠中应用。ECFP和EYFP等其它荧光蛋白变体也可进行更复杂的研究。所有这些荧光蛋白变体就像EGFP一样，能够在ES细胞和小鼠中得以应用。目前，人们已经建立了多种仅用一种荧光蛋白标记的ES细胞，如ECFP、EGFP、EYFP，并且用它们生产了表达不同GFP变体报告基因的小鼠品系。最近，研究人员在转基因小鼠研究中混合使用多种荧光蛋白作为报告基因，证明了不同的荧光蛋白变体可在神经元中选择性表达，从而获得了表达两种不同荧光蛋白的转基因小鼠，并且能够在同一动物体内比较不同的神经元亚群。

目前，采用多种荧光蛋白作报告基因的转基因小鼠，多数是经过多次重组得到的。图15采用的策略就是将各自表达不同报告基因的组合转基因动物或组织进行混合重组。如图15，将黄色（EYFP+）和蓝绿色（ECFP+）荧光的ES细胞混合，产生的嵌合体就可以在同一个小鼠胚胎或成年鼠器官中同时看到两种荧光的细胞群。这样无论是在单转基因、双转基因甚至是在三重转基因动物中，都能分辨清楚单独表达某一种荧光蛋白的细胞。

2.2 我国科学家2007年获得体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪

2007年，我国东北农业大学的科学家利用体细胞核移植技术成功构建出绿色荧光蛋白转基因猪（图16和17）。他们用脂质体转染猪胎儿成纤维细胞，筛选绿色荧光蛋白基因转染的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体，体外成熟卵母细胞为核受体，从而获得绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎。他们共获得6头克隆猪，其中4头为GFP阳性，经DNA检测确认为GFP转基因猪。

该研究对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要价值，为转基因猪育种、人类疾病模型和人类器官移植研究奠定了良好的基础。

转自： http://www.lifeomics.com/?p=20093