人类组织白细胞抗原（hla）（转）

dr.qinan

一、HLA简介
人类白细胞抗原（human leukocyte antigen），简称HLA。位于人类第六号染色体短臂的人类主要组织相容性复合体(Major Histocompatibity Complex， MHC)的基因编码表达的产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答的功能。HLA系统是迄今为止发现多态性最高的基因系统之一，这些等位基因以相同的频率出现具有明显的人种和地区的差异。

二、HLA基因结构
据资料显示，该区域全长3.6mb（106碱基对），共有224个基因，其中128个基因可能表达，而大部分尚未知有任何功能。HLA区域大致分为三大类型：Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类。Ⅰ类位于近端粒，主要编码传统的移植抗原HLA-A、B、C，Ⅱ类位近着丝粒端，主要编码HLA-DP、DQ、DR，于Ⅲ类位于二者之间，密集着许多功能各异的基因，包括一些控制补体系统成分的基因。

图1 HLA基因结构示意图
1．  Ⅰ类基因区位于着丝点的远端，主要包括HLA-A、B、C三个位点；新近又提出E、F、G、H、K和L位点。
2．  Ⅱ类基因区位于着丝点的近端，是结构最为复杂的一个区，主要由DR、DQ、DP三个亚区构成，每个亚区又有若干个位点。新近又鉴定了DO、DZ、DX三个亚区。
3．  Ⅲ类基因区含有编码补体成分C2、C4、B因子及TNF、热休克蛋白和21羟化酶的基因。
4．  非HLA基因这些基因位于HLA区域内，其功能与HLA相关；目前已经命名的有两类：LMP（largemultifunctionalprotease，或lowmolicularweightpolypeptides）和TAP（transporterassociatedwithantigenprocessing，或transporterofantigenpeptides）。LMP为蛋白酶体相关基因，由LMP2和LMP7组成；TAP为ABC转运蛋白基因，包括TAP1和TAP2；它们的功能可能与抗原的处理和递呈有关。
二、HLA的遗传学基础
HLA复合体是迄今已知的人体最复杂的基因复合体。HLA复合体的每一个位点均存在为数总多的复等位基因，这是HLA高度多态性的最主要原因。HLA复合体中每一个等位基因均为共显性基因，从而大大增加了人群中HLA表型的多样性。借助目前的血清学分型技术，已经确定的HLA基因产物即血清学抗原共有135个，其中A位点基因编码的抗原有27个，B位点有59个，C位点有10个，DR位点有24个，DQ位点有9个，DP位点有6个。HLA抗原具有高度多态性，是最复杂的遗传系统之一，其表型之多难以计数。某些基因的频率在不同种族之间判别也很大，少数HLA特异性只见于某些种族。
遗传学上将某一个体同源染色体上对应位置的一对基因称为等位基因（alleles）；当群体中位于同一位点的等位基因多于两种时，称为复等位基因（muotiplealleles）。HLA复合体I类和II类基因位点多为复等位基因。
HLA各座位基因呈等显性遗传系统，即每个基因所决定的抗原都在细胞膜上显示，同一条染色体上不同位点的等位基因紧密连锁在一起，组成单倍型，从亲代传给子代。因此每个人都有分别来自父母的两个单倍型。对一个个体做HLA分型时，得到的是表型结果。每一位点最多检查出两个抗原。如只检查出一个抗原说明是纯合子，或是带一个空白基因，只有通过家系调查才能知道其基因型。第十二届组织相容性会议公布的用血清学、MLR和PLT确认的HLA特异性见表6-1。
表1 HLA I类和II类基因特异性总表
A  B  C  DR  DQ  DP
A1  B5  B78  Cw1  DR1  DQ1  DPw1
A2  B7  B47  Cw2  DR103  DQ2  DPw2
A203  B703  B48  Cw3  DR2  DQ3  DPw3
A210  B8  B49(21)  Cw4  DR3  DQ4  DPw4
A3  B12  B50(21)  Cw5  DR4  DQ5(1)  DPw5
A9  B13  B51(5)  Cw6  DR5  DQ6(1)  DPw6
A10  B14  B5102  Cw7  DR6  DQ7(3)  
A11  B15  B5103  Cw8  DR7  DQ8(3)  
A19  B16  B52(5)  Cw9(w3)  DR8  DQ9(3)  
A23(9)  B17  B53  Cw10(w3)  DR9   
A24(9)  B18  B54(22)    DR10   
A2403  B21  B55(22)    DR11(5)   
A25(10)  B22  B56(22)    DR12(5)   
A26(10)  B27  B57(17)    DR13   
A28  B2708  B58(17)    DR14   
A29(19)  B35  B59    DR1403   
A30(19)  B37  B60(40)    DR1404   
A31(19)  B38（16）  B61(40)    DR15(2)   
A32(19)  B38（16）  B62(15)    DR16(2)   
A33(19)  B3901  B63(15)    DR17(3)   
A34(10)  B3902  B64(14)    DR18(3)   
A36  B40  B65(14)    DR51   
A43  B4005  B67    DR52   
A66(10)  B41  B70    DR53   
A68(28)  B42  B71(70)        
A69(28)  B44（12）  B72(70)        
A74(19)  B45(12)  B73        
A80  B46  B75(15)        
  B76(15)  B81        
  B77(15)  Bw4        
    Bw6        

三、HLA抗原分子的分布
HLA抗原的主要分布在细胞膜上，不同细胞上抗原分子多少也不同。HLA I类抗原分布广泛，几乎存在于所有有核细胞，但以淋巴细胞上密度最高。在正常情况下，肝细胞和心肌细胞上极少或缺失。成熟红细胞上无HLA-A，B，C和D抗原，而幼稚红细胞上有，但随成熟度增加而减少，除细胞外，血浆中也有相当含量的可溶性HLA I类抗原可能是由细胞膜上分离下来的。血小板除有HLA-A，B抗原外，还可从血浆中吸附一部分可溶性HLA抗原。血小板上某些HLA抗原如BW4和BW44，较淋巴细胞的高40倍。
HLA II类抗原较I类范围窄，主要存在于B淋巴细胞、巨噬细胞和其他抗原呈递细胞，以及胸腺上皮细胞和活化T细胞表面。在血管内皮细胞和精子细胞表面也可少量表达。

四、HLA的分型技术
1、  血清学分型
⑴基本原理
HLA细胞毒抗体属于免疫球蛋白IgG和IgM类型的抗体。此抗体在补体存在的情况下，能够结合到带有相应抗原的活淋巴细胞膜表面上，并在膜上打洞，如淋巴细胞不带有相应抗原则无此作用。细胞膜被破坏的死淋巴细胞，可以用数中方法观察此结果，其中最简单的方法是采用染色法（伊红或锥篮）。染料进入死细胞后使死细胞体积增大并着色，活细胞不被着色，根据死亡细胞占全部检测细胞的百分比的试验结果，来判断抗体与抗原的反应的强度。
⑵ 微量淋巴细胞毒实验技术
HLA-A、B、C、DR或DQ位点的抗原可用血清方法进行检测，所以称为SD抗原(serologicallydefinedantigen)，其检测方法目前普遍采用补体依赖的细胞毒(complementdependentcytotoxicyty，CDC)试验。
试验原理：淋巴细胞表面具有HLA抗原，当特异性抗体（IgG或IgM）与淋巴细胞膜上相应的HLA抗原结合，激活补体，在补体的作用下，改变细胞膜的通透性，细胞膜破损，染料可以进入，通过着色细胞死亡的数目来判断抗原、抗体反应的强度。死亡细胞与反应强度呈正比。如淋巴细胞不带有相应的抗原，则无此作用。
试验方法：美国国家卫生研究院(NIH)的标准方法如下：将一系列已知特异性的标准分型血清(1μl/孔)按设计好的方案加到72孔或60孔专用反应板中(如暂时不用可以冰冻保存)；加入待检淋巴细胞2000个/1μl/孔，置室温30min让抗体与抗原结合；加入补体(多为家兔混合血清)5μl，置室温60min；每孔加入5%伊红2～3μl，使死细胞着色；3～5min后每孔加12%福尔马林8μl固定细胞；待细胞全部沉淀后用相差显微镜或倒置显微镜观察结果。某孔的着色细胞超过50个即为阳性反应，说明被检细胞的HLA型与该孔所加抗体的相一致；否则为不一致。

2、  细胞学分型技术
HLA-D和DP位点的抗原须用细胞法分型进行鉴定，所以又称LD抗原(lymphocyte
Defined antigen)，其鉴定方法有HTC阴性分型技术，PLT阳性分型技术和MLC技术。普遍采用混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture，MLC)，也称混合淋巴细胞反应(mixed lymphocytere action，MLR)。
⑴ MLC分型技术
MLC分为双向法和单向法。双向MLC是反应管中两种细胞都有应答能力，可以互为刺激细胞和反应细胞。
① 双向MLC
试验原理：双向MLC是直接把未经任何处理的两个个体的淋巴细胞混合培养，如果它们的HLA-D抗原相同或相容，则相互刺激作用很小，细胞无变化；反之，如果双方HLA-D抗原不相容，则相互刺激作用就大，细胞内活化并产生增殖，增殖的程度与两个个体的HLA-D抗原不配合程度成正比。
试验方法：将分离的反应细胞(通常是患者的淋巴细胞)与刺激细胞(通常是供者或已知的标准淋巴细胞)配制成1×106/ml浓度的悬液，各加0.2ml到反应管中；放置37℃和5%CO2环境下培养5～6天。培养结束后进行涂片染色，观察并计数转化的淋巴细胞；也可在培养结束前5～12小时加入3H-TdR，收获后用液体闪烁仪计数细胞的放射性。试验结果的常用表示方式是刺激指数(SI)。
双向MLC只能反映两种细胞间LD的差别，结果比较模糊，也不能做LD抗原的分型。单向MLC是将刺激细胞用丝裂霉素C(mitomycinC)或X线照射先行灭活，但细胞的抗原性保持不变，因此可作为刺激细胞而不能作为反应细胞，试验结果是待检测细胞的反应，使于结果分析。
②单向MLC
试验原理：两个个体的淋巴细胞如一方事先用自力霉素C或X线照射使其失去应答的能力，但保持刺激能力。刺激细胞通过处理不再增殖，没有经过处理的应答细胞，能识别外来刺激细胞的HLA-D抗原，发生增殖，用同位素3H标志胸腺嘧啶被结合的情况，能叫精确的反映出细胞增殖的程度。

⑵ HTC分型技术
纯合子分型细胞(homozygous typing cell，HTC)试验是指细胞内一对同源染色体上两个HLA单倍型完全相同，所以该位点在细胞表面只表达一种抗原；HTC可从近亲婚配的子代表中寻找。将一组HTC经处理来活后作为刺激细胞，与待检细胞做单向MLC。如果待检细胞与刺激细胞的LD不同，就会发生反应；如果相同便不反应；所以试验又称为阴性分型法。当SI≤2时可认为待检细胞与该管HTC的LD抗原相同。本法的缺点是HTC难以得到，而且培养时间长(5～6天)，在尸体器官移植时不能应用。

⑶ PLT分型技术
预敏淋巴细胞分型(primed lymphocyte typing，PLT)试验方法需事先准备分型细胞：选择只有一个单倍型相同的两个体a/b和a/c(这在双亲与子女之间不难做到)，取前者的淋巴细胞处理后作刺激细胞，取后者的淋巴细胞作反应细胞；将两者进行单向混合培养，至第10天使可得到针对b单倍型有特异性免疫应答能力的预致敏分型细胞(PTL)。依此类推，可以制备出一系列能识别各种已知LD抗原的一套PTL；这些处于休止状态的致敏记忆细胞可在液氮中长期保存备用。
进行PLT试验时，需将待检淋巴细胞处理成刺激细胞，而PTL为反应细胞；如果待检细胞的LD抗原与PTL预先识别的特异性相同，则PTL会迅速出现反应(二次应答)，如不同则不出现快速反应，所以本法又称为阳性分型法。PLT法克服了HTC法试验周期长的缺点，在24小时内即可报出结果；PTL比HTC容易得到，但真正做起来也复杂。

3、  单克隆抗体分型技术
单克隆抗体是机体免疫细胞特异地识别和抗击外来“抗原”入侵而产主的一大类生物活性物质。
原理：淋巴细胞膜上具有不同的HLA抗原。当抗原与单克隆抗体结合时，可发生抗原抗体免疫反应。在补体的参与下，导致细胞膜溶解。通过细胞染色，可在显微镜下判断被测抗原阳性或阴性。

4、  DNA分型技术
⑴ 原理
根据HLA核苷酸碱基序列的多态性和已知的DNA序列，设计一系列的等位基因型别特异性顺序引物。引物的3’-端碱基根据多态性序列与其严格互补。通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的型别特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带。如果是纯合子，产生一条与特异引物相对应的扩增带；如果是杂合子则产生两条与特异引物对应的扩增带。
目前最常用的DNA分型技术有四种：正相PCR-SSO、反向PCR-SSO、PCR-SSP和PCR-SSCP。
⑵ PCR/SSO技术
此法用人工合成的HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针，与待检细胞经PCR扩增的HLA基因片段杂交，从而确定HLA型别，PCR技术可将HLA复合体上指定基因片段特异性地扩增5～6个数量级；而专门设计的SSO（序列特异的寡核苷酸sequencedpecific oligonucleotide）探针又能探测出等位基因间1～2个核苷酸的差异，故PCR/SSO技术具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点。
⑶ PCR/SSP技术
目前常规的HLA-DNA分型技术，包括上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最终均需用标记的特性探针与扩增产物进行杂交，再分析结果。PCR/SSP方法用乃设计出一整套等位基因组特异性引物（sequence specific primer,SSP），借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。
由于传统方法在Ⅱ类抗原分型方面困难较大，故上述几种基因分析型方法目前主要用于Ⅱ类基因座。此外，目前已建立的HLA基因分型技术还包括PCR单链构像多态性分析（PCR-single strand conformational polymorphism，PCR-SSCP）和PCR 异源二聚体电泳多态即PCR指纹图（PCR fingerprinting）分析。

五、HLA血清分型与基因分型的比较
自60年代创立微量淋巴细胞毒技术，血清学成为HLA分型研究的经典方法。随着分子生物学技术的发展和测序研究的深入，新的抗原特异性不断被发现。目前，A抗原特异性86个、B抗原185个、C抗原超过46个。血清学难以获得相应的抗体，使空白频率明显高于实际情况。HLA抗原之间高度的同源性，使血清学难以获得单价特异性抗体，交叉反应使血清学结果判断带来误差，特别是非白种人群的检测误差率更高。如 A19各分裂子的确定、 B40组各等位基因的判断，常常出现技术上的困难，有时只能根据人群的种族和地域抗原频率分布特点来确定。血清学检测的是淋巴细胞膜表面抗原(表型)。新近的研究显示，部分膜抗原表达可能存在缺失或低表达或部分被覆盖，染色体遗传物质部分遗失、转录错误，部分等位基因序列血清学尚不能分辨等均可能导致血清学分型错误，尤其是肾移植受者和白血病患者更为多见。近年国外Ⅰ类抗原DNA分型的比较研究也显示，A抗原血清学分型误差在4%～10%、B抗原误差10%左右，而C抗原误差高达20%～40%，因而显著影响HLA分型在免疫遗传等基础研究和器官移植组织配型中的临床应用价值。因此，采用DNA分型方法，评价和比较我国汉族人群Ⅰ类抗原血清学分型状况，寻找更加精确可靠、适合于国情和临床应用的HLA分型技术具有重要的临床价值。
汉族人群I类抗原血清学分型，当出现明显的交叉反应、亚型的确定不肯定和空白时，有必要采用DNA分型作进一步的确认，以求作出准确的分型。从临床实际应用比较，血清学方法相对简捷、快速，可一次同时完成A、B抗原的分型，尤其适合于大样本的批量检测，作为筛选性试验具有明显的优越性。DNA分型方法在精确、可靠、重复性方面明显优于血清学方法，但操作较复杂、技术条件要求较高，耗时较长，用于大样本的筛选尚有一定的难度。因此，推荐采用血清学方法进行临床筛选，可疑样本再用DNA方法确认。

六、HLA与临床应用
⑴ HLA与器官移植
实体器官移植，如肾脏、肝脏和心脏移植，移植前应定期检测血清中是否存在抗HLA抗体，确定抗体水平（致敏程度）以及确定抗体的特异性。主要临床意义：
①  HLA抗体阳性程度高，移植物存活率降低，〉80%是移植禁忌。
②  由于抗体的波动性，应定期检测，一般每月一次。
③  确定抗体的特异性，避免应用具有相应靶抗原的供体器官。
④  HLA抗体阳性的受者，移植前应进行交叉配型。
⑤  移植后HLA抗体水平的监测，有助于判断机体的免疫状态，帮助调整免疫治疗的方案及指导免疫抑制剂的应用。
⑵ HLA与骨髓移植
骨髓移植成败的关键之一是HLA(人类白细胞抗原)配型问题，如果骨髓供者与患者(受者)的HLA不同，可能会发生两种情况，一是病人体内的免疫细胞把植入的供体细胞当作"异物"或"入侵者"进行攻击，称为"移植排斥反应"，其结果是移植失败，"种子"不能在病人体内植活。另一种可能是供体的造血细胞在病人体内植活，产生大量的免疫活性细胞，这些细胞"反客为主"把病人的组织和细胞当作"异物"和"入侵者"进行攻击，最容易受攻击的组织和器官是皮肤、肝脏和肠道，发生皮疹、黄疸、转氨酶升高和腹泻不止甚至血便，称为移植物抗宿主病（GVHD），严重者可致命。
主要临床意义与上类似。
⑶ HLA与亲子鉴定
由于HLA为人类遗传系统中一个高度多态的遗传标记物，排除能力最强，故在亲子鉴定中最具实用价值。
其作为遗传标志物的条件：① 遗传规律严格遵守孟德尔遗传定律；② 具有遗传多态性，有较高的“非父排除概率”；③ 采用的检测方法和检测结果有可重复性。
⑷ HLA与疾病的诊断
经过多年研究调查，发现许多疾病与HLA有关。不过大多数疾病的HLA分型意义有限。

五、HLA与相关疾病
HLA与疾病相关的研究开始与20世纪60年代，有关文献近万篇，涉及的疾病多达500多种。但目前通过单一的检测HLA来直接诊断的疾病不多，其中最理想的是HLA-B27与强直性脊椎炎的关联。
⑴ HLA-B27
HLA-B27基因属于I型MHC基因，基本上表达在机体中所有含核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。早在二十多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊椎炎有着高度相关性，超过90%的强直性脊椎炎患者其HLA-B27抗原表达为阳性，普通人群中仅5-10%的为阳性，而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测在病情的诊断中有着重要意义。除了强直性脊椎炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B27抗原的表达有着或多或少的相关性，比如说Reiter's综和症，HLA-B27阳性率为70-90%；关节炎性银屑病，HLA-B27阳性率为50-60%；葡萄膜炎(眼色素层炎)，HLA-B27阳性率为40-50%；溃疡性结肠炎伴有关节病，HLA-B27阳性率为5-10%等等，因此HLA-B27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。