[信息] Amazing荧光定量PCR

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发表于 2014-10-16 14:32:26 | 显示全部楼层 |阅读模式
启因生物:www.wcgene.com

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。于1996年由美国Applied biosystems公司推出,是指对DNA或经过反转入(RT-PCR)的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程,在扩增的指数增长期就测量扩增产物,因为扩增指数增长期测量值与特异DNA(RNA)起始量存在相关性,从而实现定量检测。

Real Time PCR可检测的样品包括新鲜、冰冻、甲醛固定的样品;石蜡切片;整个组织样本;显微切割样本;单个细胞、组培细胞;血液、血清;总RNA或者mRNA;含目的基因的菌液,组织液,培养液等。

通过在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使每一个循环变得“可见”,最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(or cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。

相比于其他检测技术,Real Time PCR有着自身的优点:

1、特异性好,使用特异性探针对定量分子进行识别,具有很高的准确性,假阳性低。

2、灵敏度高,荧光PCR是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的检测技术,因此它的检测灵敏度很高。

3、线性关系好、线性范围宽,由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系,通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量;定量范围可在 0-1010拷贝/毫升。

4、操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内进行,一步完成,不需要开盖,不易污染,不需要后期处理,不再需要担心放射性污染。

这些优点决定了其在疾病诊断及生命科学研究中有着非常重要且广泛的作用。

应用real time PCR技术,我们可以对病毒及病原菌进行定性分析,包括各型肝炎、艾滋病等传染病诊断和疗效评价;地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测;肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断;遗传基因检测实现遗传病诊断;动物疾病检测(禽流感、新城疫、沙门菌、大肠埃希菌、寄生虫病、炭疽芽孢杆菌等);食品安全:食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。相比以往的药敏试验,接种感染实验以及免疫学等检测方法,不仅样本量需求少,而且操作简便,省时,灵敏度高,特异性好,结果更可靠。同样的还可应用于物种鉴定,基因分型等定性分析研究。

real time PCR技术不仅可用于定性分析,更多的是用于定量分析。其中绝对定量可用于(1)病毒及病原菌定量分析;(2)导入基因拷贝数解析;(3)GMO(转基因生物)定量检测。相对定量则多用于(1)差异显示结果验证,例如某一基因在生物体内不同发育阶段,不同组织器官的表达量差异或者在正常生物体与异常生物体(病变,用药,损伤等)的表达差异;(2)基因芯片结果验证;(3)siRNA效果确认;(4)mRNA表达量分析。  

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