如何收集到更多的有丝分裂细胞

阿平

做哺乳动物细胞有丝分裂研究的人会遇到的第一个问题如何收集到处在有丝分裂期的细胞（mitotic cell），下面分享一下我的一些经验和思考。
1.要同步细胞周期还是不同步？
有丝分裂的细胞在细胞中比例很小，常规的方法都是先把细胞用某些药物阻滞同步到有丝分裂期，然后再收集这些细胞。但是如果要研究的细胞过程和这些药物的组织机理相同，则很难用，比如你要研究有丝分裂的纺锤体形成和延长，如果用nocodazole这种spindle poison来阻滞细胞，则很难实施。

2.常用的周期同步药物
主要是抗纺锤体微丝聚合（如nocodazole）、微丝稳定剂（如Taxol），有丝分裂相关kinesin阻滞剂（如Eg5 inhibitor monastrol）。

3. 如何收集细胞
收集细胞的方法要根据你的实验目的和使用的细胞同步方法来选择。比如你的实验对细胞群体的motitic index不是很关注，完全可以把细胞培养皿中的细胞直接收集（用刮或胰酶的方法）。如果你需要比较纯的有丝分裂细胞，那么就用shake off的办法。一般要使用flask培养细胞，让后放到摇床上，用200-300RPM摇10-30分钟，这样所有的有丝分裂细胞由于着壁能力差，都悬浮到培养液中了，你收集并离心一下培养液，就得到比较纯的细胞了。

4.我常用的几个protocol（主要使用nocodazole）
A.直接用nocodazole阻滞。 用100ng/ml nocodazole 阻滞 16h-18h（nocodazole的浓度和时间需要根据具体的细胞系来调整，浓度高点虽然可能收获更多的细胞，但是细胞死亡也将增加，阻滞时间太长，细胞也会大量死亡（凋亡）。

B. 先用Thymidine把细胞阻滞在S期，然后释放后再用nocodazole阻滞。2mM thymidine培养24h，然后换培养液去除thymidine，并培养大约3h，之后再加入100ng/ml nocodazole 大约12h.
参考文献：  MCB Vol. 13, Issue 6, 1977-2000, June 2002, Michael L. Whitfield et al.  

C.双重thymidine阻滞，再用nocodazole阻滞。2mM thymidine培养16h，然后换培养液去除thymidine，培养10h，之后再加入2mM thymidine 培养16小时，换液去除thymidine培养3h，最后再加入40ng/ml nocodazole 大约18h. 这个办法的好处是得到细胞的mitotic index高（95%～），并且由于nocodazole用量少，细胞看上去也更健康些。
参考文献：Mol Cell Biol. 2009 Apr;29(8):2068-81. Epub 2009 Feb 2. St-Denis NA et al.