染色质免疫共沉淀

dr.qinan

染色质免疫共沉淀技术（ChIP）
　　真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
　　染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。
　　它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
　　ChIP的一般流程：
　　甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。
　　在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
　　具体操作流程：
　　第一天：
　　（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
　　1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％（培养基共有9ml）。
　　2、37摄氏度孵育10min。
　　3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。
　　4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
　　5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
　　6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。
　　7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。
　　（二）、除杂及抗体哺育。
　　8、超声破碎结束后，10，000g 4oC离心10min。去除不溶物质。
　　留取300ul做实验，其余保存于-80oC。
　　300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M），65oC处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
　　9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。
　　再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。
　　10、1h后，在4oC静置10min沉淀，700rpm离心1min。
　　11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。
　　（三）、检验超声破碎的效果。
　　取100ul超声破碎后产物，加入4ul5MNaCl，65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
　　第二天：
　　（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。
　　12、孵育过夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。
　　13、4oC静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。
　　14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4oC颠转10min，4oC静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。
　　洗涤溶液：a.low salt wash buffer-one wash
　　b.highsalt wash buffer-one wash
　　c.LiCl wash buffer-one wash
　　d.TE buffer-two wash
　　15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul10％SDS，100ul1MNaHCO3，800ulddH2O，共1ml。
　　每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
　　16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。
　　混匀，65oC解交联过夜。
　　第三天：
　　（一）、DNA样品的回收
　　17、解交联结束后，每管加入1ulRNaseA（MBI），37oC孵育1h。
　　18、每管加入10ul0.5MEDTA，20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10mg/ml蛋白酶K。
　　45oC处理2h。
　　19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。
　　（二）、PCR分析
　　ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著，同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域：及转录因子的结合和条件特异性；组蛋白的修饰，组蛋白修饰蛋白和染色体重建。
　　ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是，可以在体内进行反应；在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像；使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点；直接或者间接（通过蛋白质与蛋白质的相互作用）的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难于获得；为了获得高丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。
　　总之，ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中，将对芯片的构建进行改进，提高其实用性。使用易于获得抗体，增加这种方法的可用性。

dr.qinan

ChIP技术的原理

染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果，比如Millipore公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。下面我们就最基本的实验步骤，实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。


1.         细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

2.         染色质断裂

交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。

Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理的结果更精致，更均一（图1）。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。因为N-ChIP没经过甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。Millipore公司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的ChIP试剂盒（EZ-Enzyme）提供。

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相比其他DNA与蛋白相互作用的研究工具，ChIP的突出优势在于通过检测蛋白(in vivo)与DNA的物理结合，研究体内真实情况下的染色质结构，因此得出确凿的诱导或阻碍转录的证据，这对构架信号调控网络至关重要。同时，通过此工具也可以区分转录调控的直接作用和非直接作用[21]，从而使研究者对转录调控过程有更精确而深刻的认识。





ChIP试验的结果示例[6]


基于上述的技术优势，ChIP首先被用来研究分子层面上的调控机制，区别于其他研究转录调控相关性的实验手段。这类分子机制研究多数是关注于DNA结合位点是否为启动子区或其他转录调控位点。例如，癌基因myc上游调控机制的研究非常之多，然而大多停留于假说阶段。Sotelo等人[20]于近期首先发现转录因子Tcf-4和β-catenin共同上调c-Myc基因调控因子enhance E的表达，然而luciferase reporter实验结果仅能证明β-catenin和转录因子Tcf-4与enhance E的相关性，无法提供证据表明这两种细胞因子如何作用于enhance E基因上。因此，他们采用了ChIP技术，证明前列腺癌LnCAP细胞中是Tcf-4而不是β-catenin直接结合到enhance E基因上，这就表明Tcf-4直接参与到enhance E的调控中。此结果与Hatzis等人[25]对直肠癌细胞系LS174T做的ChIP-CHIP测得的结果一致，证实了一直以来研究者关于myc存在远端增强子的猜测。类似地，有研究表明β-catenin与FGF2相互作用，影响神经干细胞增殖或分化，然而具体如何协同调控增殖或分化进程尚未知，直到Israsena等人[10]用ChIP试验证明了β-catenin仅在FGF2存在时与neurogenin启动子直接结合，从而调控FGF2下游信号通路。这就解释了FGF2在该信号通路中的主导作用。另一种常见的分子机制研究则是关注于DNA结合位点下游的基因，用此类基因的表达活化或抑制来解释表型上的差异。例如，Seo等人[26]采用ChIP技术分析了NeuroD结合位点的下游基因，发现了多个转录调控因子，因此得出结论，NeuroD则位于该神经发育调控网络的重要位置。

其次，ChIP也往往被用来验证其他DNA-蛋白质相互作用研究方法所得的结果。由于其他研究方法并非在体内(in vivo)实现或者尚不能得出确切结论，因此需要ChIP试验进行有力的支持。有研究[6]通过WB, MSP,EMSA等技术发现乳腺癌细胞的高度恶性与抑制肿瘤转移相关的TFPI-2基因启动子区过度甲基化有关，之后用ChIP试验则证实了该区域高度甲基化后确实转录水平因此受到影响，为上述的结论提供更充分的论据。类似的，Peng等人[13]用EMSA技术得出水稻转录因子OsLFL1结合于Ehd1基因的启动子区的初步结论后，采用ChIP在体内重复出了这个结果，因此最终能确定该转录因子的结合位置。

最后，ChIP是染色质结构改变，特别是组蛋白修饰后，研究全基因组活化或抑制作用的少数工具之一。ChIP可以针对乙酰化或者甲基化的组蛋白，富集该区域的DNA，因此可以进行基因组的多样性分析。2008年，Xiang等人[7]发现硒（Se）处理与前列腺癌细胞的DNA甲基化水平降低、组蛋白乙酰化水平升高、GSTP1（前列腺癌相关蛋白）活化有关。试验中，他们用ChIP技术富集了乙酰化H3-k9和甲基化H3-K9，对分离获得的DNA进行多个基因的PCR扩增。结果显示GSTP1基因在处理组和非处理组之间有显著差异，这表明Se处理的癌细胞GSTP1启动子相关的H3-K9乙酰化水平提高、H3-K3甲基化水平降低，预示Se可能具有调节染色质表观结构的功能。


（密理博）

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正因为ChIP技术对于表观遗传学及信号转导研究是如此之重要，默克密理博特别为该领域的科学家们专门开发了的ChIP解决方案，其中完备的ChIP试剂盒免去提前准备各种试剂（包括鲑鱼精子DNA包被的琼脂糖珠子、Protein A/G等）的麻烦，专用的ChIP抗体节省了抗体测试的时间和精力，优化的protocol大大降低了ChIP实验的难度、减少摸索实验条件的时间。经过不断的改良及完善，新一代的EZ-ChIP能够提供阴性、阳性对照和DNA纯化柱，使ChIP试验更为高效可靠，大量经典文献的引用即是其品质的保证[27-29]。另外，对于应用越来越多的ChIP on CHIP，默克密理博还提供EZ-Magna ChIP试剂盒，磁珠分离技术让ChIP跨入高通量时代，为全基因组的探索插上翱翔的翅膀。
（密理博）

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几个经典的CHIP 的protocol

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另一个protocol： Mirmira lab protocol

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oringinal chip protocol

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ChIP assay的综述
http://www.xinkexue.com/bib.php?mod=ref&refid=19974

阿平

ChIP还有一个特殊用途，就是可以用来定位蛋白，从而知道某蛋白位于染色体的哪个部位，比如说确定蛋白绑定在centremere，还是chromosome arm，是在eurochromatin区域，还是heterochromatin区域，以及酵母中特殊的mating region等。

由于哺乳动物细胞的定位序列非常复杂，缺乏统一规律，所以目前该技术主要用在酵母细胞中。