[转载]超分辨光学成像小谈

阿平

1.何谓超分辨：
       首先需准确理解超分辨的靶子，即谁被“超”了，正确的理解应是--“远场”光学分辨率被超了。“赶超”远场分辨率的方法有个途径：远场超分辨光学成像；近场超分辨光学成像。这两种超分辨的思维与方法是截然不同的。
       1873年，德国科学家阿贝（Abbe）根据衍射理论首次推导出远场衍射分辨极限（阿贝提出的空间频谱的概率，为日后显微镜发展奠定坚实的基础）。“远场衍射极限”是指一个理想点物经光学系统成像，由于衍射的限制，不可能得到理想像点，而是得到一个夫朗和费衍射像，夫朗和费衍射“零级斑”就是所谓的艾里斑。这样每个物点的像就是一个弥散斑，两个弥散斑靠近后就不好区分，这样就限制了系统的分辨率，斑越大，分辨率越低。在此基础上产生了瑞利判据，即两个物点至少应相距多远，光学仪器才能够把它们分辨开：如果一个物点衍射图样的中央主极大与另一个物点衍射图样的中央主极大傍的第一极小（第一级暗纹）重合时，就认为这两个物点是恰可分辨的。最小分辨角距离是：

2. 远场超分辨成像
    根据瑞利判据，可得知近场显微镜的分辨率为0.61l/nsina，则提高分辨率不外两种方法：其一，尽可能选择短的照明波长，如紫外光、x射线、电子等；其二，提高数值孔径，因此正常的光学分辨约为200nm，这个分辨率目前是不能满足人们对微观世界的认识，所以产生了电子显微镜（本质是利用物质波理论，减少波长）；原子力显微镜，扫描隧道显微镜等（这类成像其实本质属于近场超分辨了）。
2.1 经典的超分辨---多光子吸收超分辨
      一般圆形光斑的光强分布是高斯型的，中间光强大，即光子密度高。若荧光产生过程是多光子吸收过程，则可激发出荧光的光斑区只能是中间的大光强区，此时则简单有效的超分辨成像，目前最成功的应用是双光子扫描荧光显微镜。
2.2  我最喜欢的超分辨--受激发射损耗显微技术（Stimulated Emission Depletion, STED）
      该成像理论源于爱因斯坦的受激辐射理论，Stefan Hell创造性把该理论应用于荧光成像，最终做出了成像系统。简单的说STED是利用激发光使基态粒子跃迁到激发态，随后用整形后STED环形光照射样品，引起受激辐射，消耗了激发态（荧光态）粒子数，导致焦斑周边上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子能力，而剩下的可发射荧光区域被限制在小于衍射极限区域内，于是获得一个小于衍射极限的荧光发光点，再利用扫描及可获得亚衍射分辨率的成像，结合4pi技术可实现三维超分辨成像。2002年，Hell研究组通过STED与4Pi技术结合，实现了33nm轴向分辨率；2003年，Hell研究组获得28nm的横向分辨率。
       该方法目前可以说是最有发展前景，因为最有希望做实时、活体成像的，Hell已经实现了视频级的成像速度，但还有很大提升空间，达人们可以继续努力加油了。
2.3  随机光学重建显微技术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy， STORM）
      这个方法创始人是中国科大的毕业的庄小威教授（女），34岁获得哈佛大学的正教授职位，很猛的。这个方法可以说突破传统思想束缚，敢想敢做的典范。
      该方法基于光子可控开关的荧光探针和质心定位原理，在双激光激发下荧光探针随机发光，通过分子定位和分子位置重叠重构形成超高分辨率的图像，其空间分辨率目前可达20nm。STORM虽然可以提供更高的空间分辨率，但成像时间往往需要几分钟，同时还不能满足活体实时可视的成像的需要，发展空间很大。
2.4  饱和激发结构光照明显微技术（Saturated Structured Ilunination Microscopy, SSIM）
        是一种宽场成像方法，荧光分子在高强度激光照射下产生饱和吸收，通过求解图案中的高频信息获得样品的纳米分辨图像，已经实现了几十纳米的横向空间分辨率。由于SSIM是两维并行测量，因此可以实现很高的成像速度，但实时性比较差。
2.5  荧光激活定位显微镜技术(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)
       这个目前还不了解，听说跟storm差不多。
  
3. 远场超分辨发展简史
1992年，Stefan Hell在OC上发表文章，第一次展示4Pi显微镜
1994年，Stefan Hell在OL上发表STED理论。
1997年，Neil在OL提出SIM。
2000年，Mats Gustafsson研究了机构化照明显微镜（structured-illumination microscopy, or SIM），在Hela 细胞肌动蛋白细胞骨架成像中，在横向分辨率方面进行了双重改进。
2006年，庄小威，利用单分子发射源成像，在《nature method》发表了随机光重建显微镜（stochastic optical reconstruction microscopy ，STORM），并使用它以20纳米的分辨率观测DNA 和DNA蛋白质复合体
2006年，Samuel Hess，利用单分子发射源成像，在《Biophysical Journal》，发表荧光激活定位显微镜技术，简称(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)
2006年，Lippincott-Schwartz，Betzig， 和 Harald Hess在《science》上发表了他们的PALM方法，使用它里给细胞黏着斑和特定细胞器的蛋白质成像。
2007年，Harald Hess小组证实FPALM可以用来检测脂质筏中聚集的蛋白。
2008年，Lippincott-Schwartz的小组把PALM和单粒子失踪结合起来探测肝细胞膜蛋白的运动。
2008年，Zhuang的小组展示了 3D STORM成像，比三维空间衍射极限空间分辨率好十倍，并使用此方法在猴肾细胞中成像微管和其他分子结构，后来扩展此方法为整个细胞的多色3D成像。
2008年，Gustafsson和其他报告使用3D SIM—一种使用三束干扰光线代替二束的方法—来观测哺乳动物细胞核无法被共聚焦显微镜探测的部分。
2008年，Hell的小组在nature杂志报道使用 STED方法视频展示活神经元里突触泡的活动，与标记抗体有关的蛋白质。后来，他们把4Pi和STED结合起来产生了固定细胞线粒体的3D影像，以40— 50纳米的分辨率。

4. 近场超分辨
      近场成像主要是倏逝场探测，倏逝场不服从瑞利判据，它们能够在远小于波长的距离上显示局部的强烈变化，通过采用一个小的有限的纳米孔径或者无孔径探针探测倏逝场，为了产生二维图象，沿物体表面进行扫描，由所得到的探测数据重构图象。